L'Institut de génétique et de biologie du développement de l'Académie chinoise des sciences développe le TKO et le système d'édition génomique « tout-en-un » TRIM, réalisant une agrégation précise « en une seule étape » de caractères complexes des cultures

Dans le processus de sélection des cultures agricoles modernes, bien qu'un grand nombre d'allèles excellents aient été progressivement identifiés par séquençage, leur agrégation rapide et précise dans une même variété se heurte toujours à un goulot d'étranglement technique lié aux multiples cycles de croisements intergénérationnels et à l'optimisation répétée par essais. L'équipe de recherche de l'Institut de génétique et de biologie du développement de l'Académie chinoise des sciences (Institute of Genetics and Developmental Biology, CAS) a relevé ce défi avec succès, en développant l'outil de knockout génique précis TKO ainsi que le système d'édition génomique composite « tout-en-un » TRIM (Targeted Replacement, Insertion and Mutagenesis), ouvrant une nouvelle voie pour l'amélioration dirigée « en une seule étape » de caractères agronomiques complexes.

Pour relever les défis posés par les cycles longs et l'efficacité limitée de l'édition génique conventionnelle dans les cultures polyploïdes et l'amélioration coordonnée de gènes multiples, l'équipe de recherche a développé, sur la base de la stratégie d'édition guidée par double ARN guide (twin prime editing, twinPE), un outil de knockout hautement efficace ciblant l'insertion site-spécifique d'amas de codons stop (Stop codon clusters), le TKO. Cet outil permet d'écrire avec précision des codons stop pour réaliser une inactivation déterministe des gènes cibles, évitant par mécanisme le problème des mutations in-frame facilement introduites par la nucléase CRISPR/Cas9 conventionnelle en raison de la jonction non homologue (NHEJ). Les expériences montrent que le TKO présente une excellente activité d'édition dans les protoplastes des principales cultures monocotylédones telles que le riz, le blé et le maïs, avec une efficacité moyenne de knockout d'un gène unique atteignant 96,8 % dans les plants régénérés de génération T0 de riz. Les 10 systèmes TKO orthogonaux construits sur cette base ont permis de réaliser avec succès le knockout précis simultané de jusqu'à 10 gènes dans un seul plant.

Afin de franchir davantage la limite de la dépendance à des outils dispersés pour différents types d'édition génique, l'équipe a proposé une architecture d'édition « tout-en-un » et a successivement développé deux systèmes intégrés, TRIM1 et TRIM2. Dans la validation sur les plants de riz de génération T0, TRIM1 a permis de réaliser simultanément le knockout d'un gène et l'édition précise homozygote de 3 gènes différents, avec une efficacité d'édition composite de 22,8 % ; le système TRIM2, version encore améliorée, non seulement conserve toutes les capacités de knockout et d'édition de bases de TRIM1, mais ouvre également la voie à des manipulations de restructuration génomique de haut niveau telles que l'insertion site-spécifique, le remplacement, la délétion, l'inversion et la translocation chromosomique de grands fragments d'ADN de l'ordre du kilobase (Kb).

Afin de réduire considérablement les barrières à la conception bio-informatique et à la construction de vecteurs en laboratoire humide, l'équipe de recherche a simultanément développé le logiciel de conception automatisée associé TKO_PegDesigner et établi une stratégie d'assemblage hautement efficace de multiples (pe)gRNA basée sur deux tours de ligation, permettant en une seule réaction l'assemblage à haut débit de jusqu'à 36 (pe)gRNA. Le système TRIM intègre pour la première fois au niveau international l'inactivation par knockout génique, l'édition précise de nucléotides et l'ingénierie chromosomique à grande échelle sur une même base technique, fournissant un puissant support d'outillage d'ingénierie de base pour la sélection moléculaire dirigée des principales cultures céréalières et oléagineuses et l'agrégation à grande échelle de caractères d'excellence clés.